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最近， 一則關(guān)于“果凍，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在網(wǎng)上瘋傳，因破皮鞋可以提煉出明膠。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不僅老酸奶，多種果粒酸奶、谷物酸奶，甚至普通酸牛奶中，幾乎都含有中含有明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠等食品增稠劑。明膠的品質(zhì)主要取決于原料。通常來(lái)說(shuō)，合格的明膠是從動(dòng)物鮮皮、骨料內(nèi)提膠，經(jīng)6道提膠工序后，對(duì)提取的明膠進(jìn)行蒸發(fā)、干燥，最后根據(jù)多項(xiàng)控制指標(biāo)進(jìn)行混合形成成品。但為了降低成本，獲得更多利潤(rùn)，國(guó)內(nèi)很多廠家用皮革廠經(jīng)過(guò)鞣鉻加工后的藍(lán)礬皮的皮革屑，邊角料、爛皮革等作為生產(chǎn)原料。皮革制成的明膠透明，無(wú)味，消費(fèi)者根本無(wú)法將正規(guī)的食用明膠和皮革制成的明膠區(qū)分開(kāi)來(lái)。

皮革水解蛋白是皮革廢料或動(dòng)物皮毛、臟器等水解生成的一種蛋白粉，對(duì)于乳與乳制品中皮革水解蛋白的鑒定，主要是通過(guò)對(duì)L-羥脯氨酸含量的測(cè)定。L-羥脯氨酸是膠原蛋白(皮革水解蛋白)特有的氨基酸，在乳酷蛋白中則沒(méi)有，所以一旦檢出，則可認(rèn)為可能含有皮革水解蛋白，即可判斷該乳制品中有可能含有由廢棄皮革而來(lái)的成分。

賽智科技應(yīng)用質(zhì)檢部采用L-羥脯氨酸衍生方法，利用公司自己的LC-10Tvp高效液相色譜儀，對(duì)L-羥脯氨酸進(jìn)行了分析檢測(cè)試驗(yàn)，并通過(guò)公司的VI2010色譜工作站進(jìn)行了詳細(xì)分析，得出的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，供廣大客戶參考使用。

以下是L-羥脯氨酸的測(cè)定的詳細(xì)檢測(cè)方法：

L-羥脯氨酸的高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)定
     1 儀器與試劑
     1.1 儀器、器皿
     1.1.1 LC-10Tvp高效液相色譜儀 
     1.1.2 Vertex 色譜柱　250mm×4.6mm×5μm
     1.1.3 11 mL水解瓶
     1.1.4 1.5 mL塑料離心管
     1.1.5 20 mL玻璃具塞刻度試管
     1.1.6 5 mL玻璃具塞刻度試管
     1.1.7 0.22 μm針頭式過(guò)濾器
     1.1.8 2 mL樣品瓶
     1.2 試劑
     1.2.1 甲醇（色譜純）
     1.2.2 乙腈（色譜純）
     1.2.3 正己烷（色譜純）
     1.2.3 三乙胺（色譜純）
     1.2.4 冰醋酸（色譜純）
     1.2.5 磷酸氫二鈉（無(wú)水色譜純）
     1.2.6 磷酸二氫鈉（無(wú)水色譜純）
     1.2.7 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品
     1.2.8 蛋白水解試劑：稱取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL濃鹽酸(36%-38%，摩爾濃度約為12 mol/L)，然后加水定容至100 mL。
     1.2.9 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，然后用純水定容至1000 mL。
     1.2.10 衍生劑PITC溶液：將250 μL異硫氰酸苯酯(PITC)用乙腈定容至10 mL。
     1.2.11 三乙胺溶液：將1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。
     1.2.12 衍生劑DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶于50 mL乙腈。
     1.2.13 Na2B4O7緩沖溶液：稱取1.91 g Na2B4O7?10H2O，用50 mL純水溶解。
     1.2.14 氨基酸儲(chǔ)備液：稱取一定量L-羥脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到濃度為 0.05 mol/L的儲(chǔ)備溶液。
     1.2.15 氨基酸使用液：將儲(chǔ)備液用0.1 mol/L HCl水溶液稀釋，得到濃度為0.0003 mol/L的L-羥脯氨酸溶液。
     1.2.16 磷酸鹽緩沖溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。
     2 實(shí)驗(yàn)方法
     2.1 樣品水解
     (1) 稱取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中(1.1.3)，加入蛋白水解試劑(1.2.8)，旋緊蓋子，振蕩混勻，110 °C下反應(yīng)24 h。
     (2) 反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至100 mL蒸餾瓶中，75℃下減壓蒸餾至近干。
     (3) 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液(1.2.9)分三次溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移到20 mL玻璃具塞刻度試管(1.1.5)，再用純水定容至20 mL，待衍生。
     2.2 樣品衍生
     2.2.1 異硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法
     (1)樣品水解溶液衍生
    量取200 μL樣品水解溶液，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液(1.2.11)和100 μL衍生劑PITC溶液(1.2.10)，混勻，室溫反應(yīng)1h，加入400μL正己烷(1.2.3)，旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過(guò)濾器(1.1.7)過(guò)濾，待分析。
     (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化
    量取200 μL L-羥脯氨酸使用液*(1.2.15)，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液(1.2.11)和100 μL衍生劑PITC溶液(1.2.10)，混勻，室溫反應(yīng)1h，加入正己烷400 μL(1.2.3)，旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過(guò)濾器(1.1.7)過(guò)濾，待分析。
根據(jù)實(shí)際情況，氨基酸使用液濃度可進(jìn)行調(diào)整，本方法中氨基酸使用液濃度僅供參考。
     2.2.2 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生方法
     (1) 樣品溶液衍生
取0.5 mL樣品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度試管(1.1.6)中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液(1.2.13)和0.5 mL衍生劑DNFB溶液(1.2.12)，具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液(1.2.16)定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過(guò)濾器(1.1.7)過(guò)濾，待分析。
     (2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生
取0.5 mL L-羥脯氨酸使用液(1.2.15)置于5 mL玻璃具塞刻度試管(1.1.6)中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液(1.2.13)和0.5 mL衍生劑DNFB溶液(1.2.12)，具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液(1.2.16)定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過(guò)濾器(1.1.7)過(guò)濾，待分析。
     2.3 色譜條件
     2.3.1 異硫氰酸苯酯(PITC)衍生色譜條件
     色譜柱：   Vertex 色譜柱250mm×4.6mm×5μm
     流動(dòng)相A：  0.05mol/L乙酸鈉水溶液（冰乙酸調(diào)節(jié)PH值為6.50±0.05）
     流動(dòng)相B:   甲醇：乙腈：水=20:60:20（V:V:V）
     流速：     1.0 mL/min
     檢測(cè)波長(zhǎng)： UV 254 nm
     柱溫：     45℃
     進(jìn)樣體積： 10μL
     2.3.2 梯度程序：

2,4二硝基氟苯(DNFB)衍生色譜條件

色譜柱：   Vertex 色譜柱
    流動(dòng)相A：  0.02mol/L Na2HPO4+ 0.02mol/L NaH2PO4水溶液
    流動(dòng)相B:   甲醇：乙腈=10:90（V:V）
    流速：     1.0 mL/min
    檢測(cè)波長(zhǎng)： UV 360 nm
    柱溫：     35℃
    進(jìn)樣體積： 10μL
    梯度程序：

3 色譜圖